导语
GUIDE╲
癌症免疫治疗已经彻底改变了癌症治疗的方式，免疫治疗很大程度上依赖于对肿瘤微环境(TME)免疫景观的全面理解。单细胞转录组分析提供了一种方式，全方面研究这些肿瘤微环境（TME）中的免疫细胞。
背景介绍
今天小编给大家介绍的是年12月8日，NatureCommunications在线发表题为“Immunesuppressivelandscapeinthehumanesophagealsquamouscellcarcinomamicroenvironment”的论文。
组织学上，食管癌可分为腺癌(EAC)和鳞状细胞癌(ESCC)两种亚型。ESCC是食管癌的主要亚型，约占全球食管癌的90%。
癌症免疫治疗已经彻底改变了癌症治疗的方式，免疫治疗很大程度上依赖于对肿瘤微环境(TME)免疫景观的全面理解。单细胞转录组分析提供了一种方式，用于全方面研究这些肿瘤微环境（TME）中的免疫细胞。
数据介绍本研究纳入7例病理诊断为ESCC的患者进行单细胞RNA-seq分析，手术切除后立即获得配对的、新鲜切除的ESCC肿瘤和邻近食管组织。邻近组织离肿瘤组织至少5cm。共有个细胞保留作进一步分析。
测序平台：10xGenomics。
结果解析01ESCC中免疫细胞的scRNA-seq（1）非监督聚类确定了主要的肿瘤浸润免疫细胞类型：T细胞、NK细胞、单核细胞/巨噬细胞、树突细胞(DC)、B细胞、浆细胞和肥大细胞。
（2）与免疫细胞的marker基因表达水平一致。
（3）肿瘤和邻近组织相比之下，B细胞和NK细胞的比例下降；
肿瘤之间的免疫成分存在很大程度的差异（f）；在这些肿瘤中，T细胞占总细胞的比例不到2%（g）。
与其他癌种相比，发现ESCC属于浸润性T细胞和单核/巨噬细胞较多，浸润性B细胞较少的肿瘤类型（i）。
02T细胞和NK细胞的聚类及亚型分型（1）T细胞和NK细胞是主要的免疫*性细胞，文章识别出了CD4T细胞群，7个CD8T细胞群，1个CD4和CD8双阴性T细胞群，3个NK细胞群(a)。（2）使用已知的功能markers基因提示CD4T细胞群，识别每个细胞群差异基因(b)。（3）利用初始T细胞(na?ve)、调节性T细胞,、T细胞耗竭(Exhaustion)、细胞*性(cytotoxic)四类细胞公开的signature，对CD4T细胞群，CD8T细胞群进行转录评分(c,d)。（4）CD4T细胞群之间存在联系，Tregs中激活的一些基因(CD4-c6-foxp3)与CD4T细胞中T细胞耗竭程序特征的基因(CD4-c5-stmn1)存在重叠。03肿瘤T细胞和NK细胞状态的改变（1）比较肿瘤和邻近组织之间的T细胞簇。肿瘤中CD45+细胞中Treg簇群CD4-c6-foxp3和衰竭CD4T细胞CD4-C5-STMN1的百分比明显高于邻近组织(a，b)。
（2）T细胞耗竭的CD8T细胞在肿瘤中富集。相邻组织中T细胞耗竭的CD8T细胞的总百分比为20%，而在肿瘤中为57%(c，d)。
（3）在ESCC中，PD1在CD8T细胞中的表达始终较高(f)，肿瘤中NK细胞的主要簇群由邻近组织的NKC1-NCR3转变为NK-c3-klrc1，肿瘤中NK-c2-stmn1显著增加。
（4）分析NK三种细胞群表达差异(h，j)。
（5）分析T细胞和NK细胞簇的细胞周期，以确定细胞的增殖能力，生成G1/S或G2/M期的细胞周期基因的增殖评分。
04CD4和CD8T细胞的克隆（1）通过TCR测序观察到总共有15,个独特的TCR序列。观察到克隆扩增，克隆范围从2到(a)。
（2）与其他癌型研究一致，大多数TCR都是独特的；但TCR克隆型的组成在患者中高度可变(b)。
（3）与匹配的邻近组织相比，7名患者中有4名出现了肿瘤克隆扩张。
（4）CD8T细胞的克隆细胞明显多于CD4T细胞，CD8T细胞中细胞*性细胞簇CD8-c1-NKG7在癌旁组织中出现频率较高，在癌旁组织中也表现出较肿瘤组织中增加的克隆扩张(e)。
（5）与相邻组织相比，肿瘤中的调节性T细胞有更多的克隆(f)。
05ESCC中髓细胞功能组成明显（1）文章鉴定了骨髓细胞的无监督聚集，共鉴定出14个集群，包括9个单核/巨噬细胞集群和5个树突状细胞集群(a)。
（2）利用已发表的单核细胞基因签名，识别出巨噬细胞簇：经典活化巨噬细胞(M1)、交替活化巨噬细胞(M2)和骨髓来源的抑制细胞(MDSCs)(b)。
（3）使用Monocle（无监督推测方法）方法，来构建细胞转变的潜在发展轨迹（c），利用WGCNA对单核/巨噬细胞进行权重相关网络分析(d，e)。
（4）模块中的基因与髓系白细胞激活、免疫反应的激活相关，并进一步分析了模块中的基因及其与Mono-C1-VCAN的关系。
（5）应用单细胞调控网络推断和聚类(SCENIC)方法来探索可能调控单核细胞M1和M2发育的转录因子。
06ESCC中免疫细胞间的相互作用
（1）巨噬细胞和Tregs在肿瘤中的高浸润水平和重要的免疫调节作用，应用scTHI分析巨噬细胞和Tregs的相互作用(a-c)。
（2）巨噬细胞与Tregs之间的TNF-TNFSF1B、CCL4-CCR8、IL-1IL1R2相互作用得分较高，Tregs在肿瘤中表达高水平的TNFSF1B、CCR8、IL1R2。
（3）免疫组化验证了IL1R2在Tregs中的表达(d)。
（4）体外共培养和抗体阻断实验表明，Tregs需要IL1R2来抑制IL-1依赖的效应T细胞激活，如增殖和IFN表达(e,f)。
（5）MHC受体LILRB1是髓系细胞激活的负调控因子和M2抑制状态的启动子。MHC和LILRB1相互作用抑制巨噬细胞，是癌症免疫治疗的靶点。文章预测了巨噬细胞的LILRB1与Tregs中的MHC的相互作用。
（6）通过scRNA-seq分析巨噬细胞中LILRB1的表达，并进一步通过流式细胞仪验证。文章发现，与邻近组织相比，ESCC巨噬细胞中LILRB1的表达增加。
小编总结
总结：（1）为了描述ESCC的免疫状况，使用scRNA-seq对从七个手术切除的ESCC肿瘤及其匹配的邻近组织中分离出的全部免疫细胞进行分析。同时进行T细胞受体(TCR)测序，揭示了T细胞克隆性信息。
（2）与配对的邻近组织相比,肿瘤中主要存在T细胞、NK细胞、单核细胞/巨噬细胞、树突细胞(DC),B细胞,浆细胞和肥大细胞，提示ESCC中存在炎症且免疫抑制的TME。
（3）TCR-sequencing揭示了CD4和CD8T细胞群的谱系连接。
（4）巨噬细胞和treg之间通过配体受体相互作用的相互干扰可能有助于免疫抑制状态和疾病进展。
（5）结果全面地表征了肿瘤浸润性免疫细胞，揭示了免疫抑制状态的景观，并为应用和开发ESCC免疫疗法奠定了基础。
分析专辑
单细胞scRNA
R包绘图
免疫浸润分析
肿瘤纯度评估工具
数据库
文章解读专辑
多区域进化文章精读
高分文章精读
免疫微环境文献解读
END
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